или
Поможем найти врача
звоните (ежедн. с 08 до 21) +7 (495) 125 29 51

Вирус гепатита В, определение ДНК (количественное, реагенты F. Hoffmann-La Roche)

Описание

 Количественное определение ДНК вируса гепатита В методом ПЦР на автоматическом анализаторе Cobas TaqMan.

 Вирус гепатита В (частица Дейна) - ДНК-содержащий вирус из семейства Hepadnaviridae, диаметром 42 нм. Липопротеидная оболочка содержит поверхностный антиген HBsAg (австралийский антиген), открытый Бламбергом в 1965г. В частицах HBsAg определяются три белковых домена (Pre-S1, Pre-S2, S), липидный и углеводный компонент, а также рецептор полимеризованного альбумина рАR

 Гепатоциты (клетки печени) имеют рецептор для полиальбумина, предполагается, что с помощью рАR HBV проникает в клетку.

 Существует один главный серотип и генетически устойчивые подтипы HBsAg, определяемые набором антигенных детерминант его поверхности: adw, adr, ayw, ayr.

 В структуру нуклеокапсида (ядерного антигена - HBcAg) входят: субъединица HBeAg, ДНК-полимераза (обратная транскриптаза), протеинкиназа и ДНК.

 Молекула ДНК (HBV DNA) частично однонитчатая, кольцевой конфигурации.

 HBeAg образуется в процессе превращения белка Pre-core в структурный белок core и выделяется за пределы клетки (служит маркером репликации вируса).

 Важные функции выполняют полипептидные Pre-S домены (регионы) HBsAg.

 Pre-S1 регион HBsAg “распознается” рецепторами гепатоцита. Его содержание в крови служит отражением репликации вируса. К Pre-S1 вырабатываются вируснейтрализующие антитела, нарушение их синтеза способствует хронизации инфекции.

 Предполагается, что антитела к Pre-S2 также имеют значение для элиминации вируса.

 Вирус гепатита В во многом уникален. Его геном представлен двуцепочечной кольцевой молекулой ДНК — наименьшей из всех ныне идентифицированных ДНК у ДНК-содержащих вирусов. ДНК ВГВ состоит приблизительно из 3200 нуклеотидов, с колебаниями от 3182 до 3221 в различных изолятах вируса.

 В ДНК ВГВ идентифицированы 4 гена (S, С, Р, X). Кроме того, в геноме вируса определены регуляторные последовательности ДНК, ответственные за синтез белков и репликацию вируса. Открытые рамки считывания определенных генов частично перекрывают друг друга, что обеспечивает высокую информационную емкость генома ВГВ.

 Репликация генома вируса гепатита В во многом отлична от таковой у других ДНК-содержащих вирусов. Она начинается с проникновения вириона в гепатоцит с разрушением внешней оболочки частицы Дейна.

 При помощи ДНК-полимеразы происходит достройка одноцепочечных участков короткой цепи ДНК ВГВ с образованием РНК-репликативного посредника (прегенома) с одновременной транскрипцией и трансляцией, т. е. с синтезом вирусспецифических белков. Образовавшийся пренуклеоид включает в себя прегеномную РНК- и ДНК-полимеразу.

 Следующим этапом репликации является обратная транскрипция, т. е. синтез полной цепи ДНК на РНК матрице при помощи вирусспецифической ДНК-полимеразы, обладающей свойствами обратной транскриптазы (ревертазы) с последующим разрушением прегеномной РНК.Затем на минус цепи ДНК ВГВ происходит синтез неполной цепи ДНК ВГВ.Образовавшаяся кольцевая структура ДНК ВГВ вместе с ДНК-полимеразой включается в нуклеокапсид вируса и мигрирует в цитоплазму гепатоцита, где формируется наружная оболочка вируса, состоящая из HBsAg и липидов клетки.Как только новая вирусная частица выходит из гепатоцита, синтез плюс цепи ДНК ВГВ прекращается.Различия во времени выхода из гепатоцита вирусных частиц определяют вариабельность длины плюс цепи ДНК ВГВ.Кроме включения ДНК ВГВ в состав потомства вирусных частиц, она может интегрироваться в геном гепатоцита.Синтез белков вируса гепатита В регулируется на уровне транскрипции и трансляции. Усилители транскрипции активируют экспрессию генов вируса, действуя преимущественно в клетках печени.

 На протяжении длительного времени считалось, что гепатоциты являются единственными клетками организма, где может происходить синтез вируса гепатита В. Идентификация последовательностей ДНК и белков вируса в клетках почек, селезенки, поджелудочной железы, кожи, костного мозга и клетках крови опровергло это положение.Вместе с тем доказано, что максимальная экспрессия генов вируса гепатита В, и прежде всего S-гена, происходит только в печени, возможно, под влиянием стероидных гормонов.Одним из уникальных свойств вируса гепатита В является его взаимосвязь с развитием первичного рака печени. В настоящее время можно считать доказанной роль этого вируса в развитии опухоли.ВГВ может быть обнаружен в сыворотках крови и цитоплазме гепатоцитов больных острым и хроническим гепатитом, а также у носителей вируса

 При электронной микроскопии определяются две морфологические формы: частицы, имеющие оптически плотное ядро, содержащие ДНК ВГВ, и неполные частицы - без ДНК. Концентрация вирусных частиц в сыворотках крови с наличием HBsAg колеблется от 10 частиц в 1 мл до количеств, недоступных выявлению с помощью электронной микроскопии.

Некоторые сыворотки крови с наличием ВГВ инфекционны даже в разведениях 10-7 — 10-8 .

 Частицы ВГВ чувствительны к эфиру и неионным детергентам, которые разрушают внешнюю оболочку вириона, освобождая при этом нуклеокапсид.Многочисленные попытки культивирования ВГВ в различных клеточных культурах были неудачны.

 Для обнаружения и количественного определения ВГВ применяют иммуноэлектронную микроскопию и определение ДНК-полимеразной активности. Косвенным доказательством наличия ВГВ в исследуемом материале может быть выявление ДНК ВГВ в тесте гибридизации и амплификации , а также в иммуноферментном или радиоиммунном анализе по наличию HBcAg, выделенного из состава частицы Дейна после обработки детергентами.

 Выявление ДНК вируса гепатита В (hepatitis В virus, HBV) методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) и определение вирусной нагрузки в сыворотке крови.

Аналитические показатели:

  • диапазон достоверности теста теперь составляет 54,5 – 1,10 Е8 МЕ/мл;
  • анализируются генотипы A, B, C, D, E, F, G;
  • чувствительность теста составляет от 12 МЕ/мл;
  • специфичность теста составляет 99,9%.

 Количественная характеристика содержания ДНК HВV в клинических образцах важна для оценки эффективности противовирусной терапии.

Подготовка

Специальной подготовки к исследованию не требуется.
.

Показания

  • Положительный качественный тест на наличие ДНК вируса гепатита В в сыворотке крови.
  • Определение тактики лечения пациентов.
  • Точная оценка эффективности лечения.

Интерпретация результатов

Единицы измерения : количество выявленной ДНК вируса гепатита В, выраженная в МЕ/мл.

Референсные значения: в норме — «не обнаружено».

Форма выдачи результатов

Формулировка Интерпретация результата
«не обнаружено» Пороговое значение (Ct) для РНК ВГB не достигнуто,
результат интерпретируется как: «РНК ВГB не обнаружена».
< 12 МЕ/мл Результат интерпретируется как:
«РНК ВГB выявлена в концентрации ниже
границы чувствительности теста»
От 12 до 54,5 МЕ/мл
(ХХ МЕ/мл)
Результат интерпретируется как:
«РНК ВГB выявлена в количестве ХХ МЕ/мл;
полученное значение выходит за пределы
линейного диапазона теста;
интерпретировать с осторожностью
(в соответствии с клинической картиной)»
От 54,5 до 1,10 Е8
МЕ/мл
Полученное значение находится в пределах
линейного диапазона, результат достоверен.
Более 1,1 Е8 МЕ/мл
(ХХ ЕХ МЕ/мл)
Результат интерпретируется как:
«РНК ВГB выявлена в концентрации ХХ ЕХ МЕ/мл,
выходящей за пределы линейного диапазона;
тест ставился в разведении 1:Х»


Читать полность ...